TaqManMGBプローブおよびプライマーの設計

　C.burnetii NM株の外膜白質（coml）およびインサーション配列（ISlllla）に対するプローブとプライマーをPrimer Expressソフトウエアー（Applied Bisosystems）を用いて設計した。最終的に、他の菌ゆヒトゲノムへのホモロジーが極めて低く、C.burnetiiのみに特異性が高い各２組、計４組のプローブおよびプライマーを作成した。それぞれの配列は、QompF15’-CGC TGC CAA AGT ATC ATT AGC A-3’、QompF15’-CGC GTC GTG GAA AGC ATA A-3’、QompF15’- ATT TTC CTT GTT TAG CG-3’、QompF2 5’-ATA GCC GCC CCC TCT CAA T-3’、QompR2 5’-TCT ACT AAA ACT TCT GGG TGG TTG ACT -3’、QompP2 5’-AGT CAA AGA CAT ACA AAG C-3’、QISF1 5’-CAC CAA TGG CCA ATT TAA -3’、QISR1 5’-AAA GAA AGC GGT TGC ATT CG-3’、QISP15’-ATA TCC GGC ATC ACG A-3’、QISF2 5’-GCG AGC GTG GGT GAC ATT -3’、 QISR2 5’-ACC CAA TAA ACG CCG ACA AC -3’、QompP2 5’-ATC AAT TTC ATC GTT CCC GG -3’である。

　Real Time PCRの実施条件

　反応は、ABI PRISM 7000および7500（Applied Bisosystems）を用いて、TaqMan Universal Master Mix(2x)（Applied Bisosystems）12.5μl、プライマー各900nM、Taq Man MGB プローブ250nM、サンプルDNA10ng以上を含む計25μlの反応液で、50℃２分のUNG活性化反応、95℃10分のTaqGoId活性化およびUNG不活化反応のあと、95℃15秒および60度１分の２ステップPCRを40サイクル行った。

　検出法の感度検討

　感度の検討には、C.burnetii Nine Mile株Ⅱ相菌ホルマリン不活化死菌（以下Ⅱ相菌）を用いた。Ⅱ相菌の培養および精製は定法にしたがって行った。菌数の測定は、Ⅱ相菌を10倍段階希釈して、各希釈の10μlを直径５mmのマルチウエルプレートのウエルにのせ、乾燥および固定後、定法にしたがって蛍光染色し、10μl中の菌数を計測した。
　 計測した既知の濃度(菌数)のⅡ相菌を段階希釈して、各PCR反応に100、10、10.10.01個の菌が含まれるように調整して感度の検討を行った。

　特異性の検討

　Acinetobacter baumannii、Acinetobacter iwoffii、Alcaligenes faecalis、Acinetobacter xylosoxidans、Chryseobacterium indologenes、Escherichia coli、Flavobacterium breve、Flavobacterium odoratum、Haemophilus influenzae、Klebsiella pneumoniae、Legionella pneumophila (Serogroupl) 、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas stutzeri、Serratia marcescens、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus pneumoniae、Staphylococcus pyogenes、Listeria monocytogenes、Yersinia enterocolitica、Proteus vulgaris、Proteus penneri、Salmonella typhimurium、Salmonella enteritidis、Salmonella choleraesuis、Salmonella arizonae、Baillus subtlis、Neisseria gonorrhoeae、Mycoplasma pneumoniae、Chlamydia trachomatis、C.pneumoniae、C.psittaci、Rickettsia japonica、R.conori、R.typhii、R.prowazekii、Ehrlichia chaffeensis、E.canis、HE、E.sennetsu、Orientia tsutsugamushi　の計46株に対する反応を調べた。

　まず液卵を用いた予備実験で、卵白が混入するとDNA抽出が困難であることが判明したため、以後卵黄からの抽出法を検討した。

　PBS＋NaC1およびTween20濃度の卵黄への影響

　PBS中のNaC1の濃度を（2.9～7.9％まで）変え、卵黄へ等量を加えたときの影響を調べた。また、PBS中のTween20の濃度を（0.01～2.0％）変え、同様に解析した。
方法：

・	50～600μlの卵黄＋600μlのPBS＋NaC1溶液or PBS＋Tween20溶液を用いる。
・	激しく撹拌３分。
・	14,000rpm 15分　４℃。
・	沈渣を観察。

　スパイク試験（スモールスケール）

方法：

・	卵黄約500μlに5.9％PBS-NaC1 750μlとC.burnetii（10～10３個／tube）を加える。
・	ボルテックス３分。
・	遠心14,000rpm　30分　４℃。
・	上清をピペットで捨て、50μl程度残す。
・	130μl１ATLに20μl proteinase Kを加える。
・	200μl　AL液を加える。
・	ボルテックス。
・	56℃一晩インキュベート（時々ボルテックス）
・	200μlのエタノールを加えて、ボルテックス15秒。

　あとは、プロトコールにしたがって行う。最終的に、50μlのAE液で溶出。そのうち2.5μlを12.5μlの系でReal Time PCRに使用した。

　スパイク試験（ラージスケール）

方法：

・	卵殻の消毒：卵殻を消毒アルコール、ヨード、消毒アルコールの順で消毒、グローブも消毒する。
・	割卵：目玉焼きを作るときの要領で、割卵し、シャーレにあける。直径15cmのシャーレを使用し、４個入れる（別々でもよい）。
・	卵白を除く：卵黄を吸わないようにアスピレーターで吸って捨てる。（25mlピペット使用）。
・	25mlのピペットの先を卵黄に突き刺して、卵黄を吸引する。約10mlを50mlの遠心管に入れる。
・	菌を102～105個加える。
・	８％NaC1-PBSを20ml加える。TAITEC VR36で数分間混和する。
・	10,000rpm45分遠心する。
・	上清をデカンテーションで捨てる。さらに、残りをP1000で吸って捨てる。
・	400μlのPBS（20μl proteinase K(20mg/ml)含む）を加え、ボルテッスする。
・	56℃一晩インキュベート。
・	そのうち200μlをとって、Qiagenのプロトコールに従って、以後の操作を行い、最終的に50μlのAE液で溶出した。

　以下の都内のスーパー２店で購入した合計115個の卵について検査を行った。検査には卵黄500μlを用い、上記の方法で６％PBS-NaClを用いて行った。また、陽性コントロールとしてSalmonella enteritidisを500個および50個を500μlの卵黄にスパイクして用いた。検出には、omplおよびISIのプローブおよびプライマーのセットを用いた。また、サルモネラの検出は、サルモネラ菌invA遺伝子検出用Primer Set SIN-1,-2、（タカラバイオ株式会社）を用いた。

試供卵：
都内スーパーＡで購入。
１～11 Ｈ養鶏場（埼玉）
11～22 （20欠番）KA卵（福島）
23～32 SZ卵（埼玉）
33～42 SA卵（愛知）
43～50 SSN（愛知）

都内スーパーＢで購入
51～56 AHY（群馬）
57～62 SFたまご　サルモネラチェック
63～70 Ｗ卵（茨城）
71～80 FSの卵（茨城）
81～88 新鮮卵Ｍ（茨城）
89～94 Ｍたまご（茨城）
95～100 WO（青森）
101～108 NK卵（茨城）
109～116 MG（濃厚卵）（埼玉）

1)	佐藤　梢、小川基彦、アグス・セティヨノ、山崎　勉、岸本寿男：Real Time PCR(TaqMan)によるCoxiella burnetii検出法の開発、第21回日本クラミジア研究会・第10回リケッチア研究会、東京、2003年11月１日－２日
2)	佐藤　梢、小川基彦、アグス・セティヨノ、山崎　勉、岸本寿男：Real Time PCR(TaqMan)によるCoxiella burnetii検出法の開発、第52回東日本感染症学会、横浜、2003年10月30日－31日
3)	平井昭彦、金子誠二、仲真晶子、石崎直人、小田桐恵、甲斐明美、貞升建志、新開敬行、村田以和夫、諸角　聖、：市販牛乳中のCoxiella burnetii検査法の検討、第137回日本獣医学会学術総会、2004年４月
4)	貞升建志、新開敬行、金子誠二、平井昭彦、仲真晶子、石崎直人、小田桐恵、甲斐明美、村田以和夫、諸角　聖：マヨネーズ中のCoxiella burnetii検査法の検討、第137回日本獣医学会学術総会、2004年４月
5)	百田隆祥、小島　偵、池戸正成、小川基彦、佐藤梢、アグス・セティヨノ、岸本寿男、：LAMP法によるCoxiella burnetiiの検出の基礎、第21回日本クラミジア研究会・第10回リケッチア研究会、東京、2003年11月１日－２日
6)	Momoda,T.,Ogawa,M.,Kojima,T.,Ikedo,M.,Sato,K.,Sentiyono,A.,Kishimoto,T: Sensitive and Rapid Detection of Coxiella burnetii by Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP), a Novel DNA Amplification Method. American Society for Microbiology 104th General Meeting. New Orleans,LA, USA. May 24, 2004.

なし。

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